Сибирский федеральный университет

Номер

Журнал СФУ. Биология. 2018 11 (2)

Авторы

Кириллова, М.А.; Есимбекова, Е.Н.; Ранджан, Р; Торгашина, И.Г.; Кратасюк, В.А.

Контактная информация

Кириллова, М.А.: Сибирский федеральный университет Россия, 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79; Есимбекова, Е.Н.: Сибирский федеральный университет Россия, 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79; Институт биофизики СО РАН ФИЦ «Красноярский научный центр СО РАН» Россия, 660036, Красноярск, Академгородок, 50/50; Ранджан, Р: Сибирский федеральный университет Россия, 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79; Торгашина, И.Г.: Сибирский федеральный университет Россия, 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79; Кратасюк, В.А.: Сибирский федеральный университет Россия, 660041, Красноярск, пр. Свободный, 79; Институт биофизики СО РАН ФИЦ «Красноярский научный центр СО РАН» Россия, 660036, Красноярск, Академгородок, 50/50

Ключевые слова

NADH:FMN-oxidoreductase; bacterial luciferase; bacterial contamination; Escherichia coli; NADH:FMN-оксидоредуктаза; бактериальная люцифераза; бактериальное загрязнение; Escherichia coli

Аннотация

Для анализа микробного загрязнения широко используется биолюминесцентный метод, основанный на определении аденозин-5’-трифосфата (АТР) с помощью люциферин- люциферазной системы светляков. Существует принципиальная возможность оценки степени бактериальной обсемененности различных объектов исходя из количественного анализа других нуклеотидов. В работе исследована возможность применения биолюминесцентной системы светящихся бактерий NADH:FMN-оксидоредуктаза (Red) и люцифераза (BLuc) для количественного анализа бактериальных клеток путем определения количества никотинамидадениндинуклеотида (NADH) и флавинмононуклеотида (FMN) в образце. Для увеличения чувствительности биолюминесцентной системы к FMN и NADH осуществлена оптимизация условий проведения анализа путем подбора концентраций ферментов и субстратов в реакционной смеси. Максимальная чувствительность биферментной системы Red + BLuc составила 1,2 нМ FMN и 0,1 пМ NADH. Для проведения количественного анализа бактериальных клеток использовали модельный бактериальный образец – культуру Escherichia coli. Экстрагирование FMN и NADH проводили путем разрушения клеточной мембраны ультразвуковым дезинтегратором. Клеточную суспензию добавляли в реакционную смесь вместо раствора FMN или NADH, при этом интенсивность свечения биолюминесцентной системы зависела от количества бактериальных клеток в реакционной смеси. Введение в пробоподготовку дополнительной процедуры центрифугирования образца, подвергнутого ультразвуковой обработке, не привело к увеличению чувствительности метода. Таким образом, было показано, что чувствительности биферментной системы Red + BLuc достаточно для определения не менее 800 тыс бактериальных клеток в миллилитре путем экстрагирования NADH из разрушенных клеток. При анализе, основанном на определении концентрации FMN в бактериальном образце, чувствительность метода составила 3,9 млн клеток на миллилитр

Страницы

174-180

Статья в архиве электронных ресурсов СФУ

https://elib.sfu-kras.ru/handle/2311/71720

Эта работа лицензируется по лицензии Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License (CC BY-NC 4.0).